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Assunto: Biologia > Tema 17
Lição 1: Métodos de análise do DNASequenciamento de DNA
Como se determina a sequência de nucleótidos (As, Ts, Cs e Gs) num fragmento de DNA.
Pontos chave:
- Sequenciação de DNA é o processo de determinação da sequência de nucleótidos (As, Ts, Cs e Gs) num fragmento de DNA.
- Na Sequenciação de Sanger, o DNA alvo é copiado múltiplas vezes, produzindo fragmentos de diferentes tamanhos. Nucleótidos "terminadores de cadeias" fluorescentes marcam as pontas dos fragmentos e permitem a sequências ser decifrada.
- A técnica de Sequenciação de nova geração é uma abordagem recente e em grande escala que aumenta a rapidez e reduz o custo da sequenciação de DNA.
O que é a sequenciação?
Já deves ter ouvido falar de sequenciação de genomas. Por exemplo, o genoma humano foi concluído em 2003, após um esforço internacional de vários anos. Mas o que significa sequenciar um genoma, ou mesmo um pequeno fragmento de DNA?
A sequenciação de DNA é o processo através do qual se determina a sequência das bases (As, Ts, Cs e Gs) num fragmento de DNA. Atualmente, com o equipamento e materiais certos, sequenciar uma pequena parte de DNA é relativamente simples.
Sequenciar um genoma inteiro (todo o DNA de um organismo) continua a ser uma tarefa complexa. Requer a divisão do DNA do genoma em várias peças mais pequenas, sequenciar essas peças e reunir as sequências num único e longo "consenso". No entanto, graças a novos métodos que foram desenvolvidos nas últimas duas décadas, sequenciar um genoma é agora muito mais rápido e barato do que era durante o Projeto do Genoma Humano
Neste artigo, iremos dar uma vista de olhos aos métodos usados para a sequenciação de DNA. Centrar-nos-emos num método bem estabelecido, a sequenciação de Sanger, mas iremos também discutir novos métodos ("nova geração") que reduziram o custo e aumentaram a rapidez da sequenciação em grande escala.
Sequenciação de Sanger: O método de terminação da cadeia
Regiões de DNA de até
No Projecto do Genoma Humano, a sequenciação de Sanger foi utilizada para determinar as sequências de muitos fragmentos pequenos de DNA humano. (Estes fragmentos não tinham necessariamente
Embora os genomas sejam agora tipicamente sequenciados utilizando outros métodos que são mais rápidos e menos dispendiosos, a sequenciação de Sanger ainda é largamente utilizada para a sequenciação de fragmentos individuais de DNA, tais como fragmentos utilizados em clonagem de DNA ou gerados através de reação em cadeia da polimerase (PCR).
Ingredientes para a sequenciação de Sanger
A sequenciação de Sanger envolve a realização de muitas cópias de uma região de DNA alvo. Os seus ingredientes são semelhantes aos necessários para a replicação de DNA num organismo, ou para a reação em cadeia da polimerase (PCR), que copia o DNA in vitro. Incluem:
- A enzima DNA polimerase
- Um primer, que é uma pequena parte de DNA de cadeia simples, que se liga ao template de DNA e atua como um "iniciador" para a polimerase
- Os quatros nucleótidos de DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
- O template de DNA a ser sequenciado
No entanto, a reação de sequenciação de Sanger também contém um ingrediente único:
- Versões didesoxi, ou terminadoras de cadeia dos quatro nucleótidos (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada um marcado com uma cor diferente
Os nucleótidos didesoxi são semelhantes aos nucleótidos comuns, ou deoxi, mas com uma diferença fundamental: têm um grupo hidroxilo a menos no carbono 3' do anel de açúcar. Num nucleótido comum, o grupo hidroxilo 3' atua como um "gancho", o que permite adicionar um novo nucleótido à cadeia existente.
Quando um nucleótido didesoxi é adicionado à cadeia deixa de haver um grupo hidroxilo disponível, não se podendo ligar mais nucleótidos. A cadeia termina com o nucleótdio didesoxi que está marcado com uma cor específica dependendo da base (A, T, Cou G).
Método de sequenciação de Sanger
A amostra de DNA a ser sequenciada é combinada num tubo com um primer, a DNA polimerase e os nucleótidos de DNA (dATP, dTTP, dGTP, e dCTP). Adicionam-se também os quatro nucleótidos de terminação de cadeia marcados mas, em quantidades muito menores do que os nucleótidos normais.
A mistura, em primeiro lugar, é aquecida para desnaturar o DNA (separar as cadeias), sendo depois arrefecida para que o primer se possa ligar ao template de cadeia simples. Depois do primer ligado, a temperatura é novamente aumentada, permitindo que a DNA polimerase sintetize o novo DNA a partir do primer. A DNA polimerase continuará a adicionar nucleótidos à cadeia até que adicione um nucleótido didesoxi em vez de um normal. Nesse momento, não podem ser adicionados mais nucleótidos, pelo que a cadeia irá terminar com o nucleótido didesoxi.
Este processo é repetido em vários ciclos. Quando o ciclo está completo, é virtualmente garantido que um nucleótido de didesoxi terá sido incorporado em cada posição do DNA alvo, em pelo menos uma reação. Ou seja, o tubo irá conter fragmentos de diferentes comprimentos, terminando em cada uma das posições do nucleótido no DNA original (ver figura abaixo). As extremidades dos fragmentos serão marcadas com cores que indicam o seu nucleótido final.
Após a reação ocorrer, os fragmentos passam por um tubo longo e fino que contém uma matriz de gel e passam por um processo chamado eletroforese capilar em gel*. Os fragmentos curtos movem-se rapidamente através dos poros do gel, enquanto que os fragmentos longos se movem mais lentamente. À medida que cada fragmento atravessa a "linha de chegada" na extremidade do tubo, é iluminado por um laser, permitindo a deteção da cor do marcador.
O fragmento mais pequeno (que termina apenas um nucleótido após o primer) atravessa primeiro a linha de chegada, seguido pelo próximo fragmento mais pequeno (que termina dois nucleótidos após o primer), e assim em diante. Assim, a partir das cores dos marcadores registados um após o outro no detector, a sequência da peça original de DNA pode ser construída um nucleótido de cada vez. Os dados registados pelo detector consistem numa série de picos de intensidade de fluorescência, como mostra o cromatograma acima. A sequência de DNA é lida a partir dos picos no cromatograma.
Utilizações e limitações
O método de sequenciação de Sanger fornece sequências de alta qualidade para extensões relativamente longas de DNA (até cerca de
No entanto, a sequenciação de Sanger é dispendiosa e ineficiente para projectos de maior escala, tais como a sequenciação de um genoma completo ou metagenoma (o "genoma colectivo" de uma comunidade microbiana). Para tarefas como estas, as novas técnicas de sequenciação em grande escala são mais rápidas e menos dispendiosas.
Sequenciação de nova geração
O nome pode soar a Star Trek, mas é mesmo assim que é chamado! O conjunto mais recente de tecnologias de sequenciação de DNA é colectivamente referido como sequenciação de nova geração*.
Há uma variedade de técnicas de sequenciação de nova geração que utilizam diferentes tecnologias. No entanto, a maioria partilha um conjunto comum de características que as distinguem da sequenciação de Sanger:
- Alto paralelismo: muitas reações de sequenciação ocorrem ao mesmo tempo
- Microescala: as reações são minúsculas e muitas delas podem ocorrem de uma só vez num chip
- Rapidez: como as reações ocorrem em paralelo, os resultados são obtidos de forma muito mais rápida
- Baixo custo: sequenciar um genoma é mais barato do que com o método de Sanger
- Menor tamanho: as leituras tipicamente variam entre
Concetualmente, a sequenciação de nova geração é como executar em paralelo um número muito grande de pequenas reações de sequenciação deSanger. Graças a esta paralelização e pequena escala, grandes quantidades de ADN podem ser sequenciadas de forma muito mais rápida e barata com métodos de nova geração do que com a sequenciação de Sanger. Por exemplo, em 2001, o custo da sequenciação de um genoma humano foi de quase
Por que é que a sequenciação rápida e barata é importante? A capacidade de sequenciar rotineiramente genomas abre novas possibilidades para a investigação em biologia e aplicações biomédicas. Por exemplo, a sequenciação de baixo custo é um passo em direcção à medicina personalizada - ou seja, tratamento médico adaptado às necessidades de um indivíduo, com base nas variantes genéticas do seu genoma.
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